BRATISLAVA. Výsledkom je nadmerné zrážanie krvi v žilách, problémy s kosťami a väzivami, vyvrátené očné šošovky, mentálne postihnutie a niekedy aj smrť.
Za tým všetkým, dedičnou homocystinúriou, sú ťažkosti s enzýmom, ktorý je kľúčový pri spracovaní istého druhu aminokyselín. Vedcom sa teraz prvý raz podarilo vyriešiť, ako tento enzým vyzerá v troch rozmeroch, a tak pochopiť, ako funguje. Vďaka tomu by mohla vzniknúť nová generácia liekov.
Prvým autorom štúdie v prestížnom magazíne Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) je aj mladý slovenský vedec Tomáš Majtán z Ústavu molekulárnej biológie. Výskum prebiehal na Coloradskej univerzite.
Uznávaný magazín
„Moja práca spočívala v pokračovaní prípravy enzýmu pre kryštalizačné testy, ktoré sa začali už pred dvomi dekádami,“ vysvetľuje pre SME Majtán. „No po dvoch rokoch práce na tomto projekte som zistil, že pôvodný prístup nikam nevedie.“
Tím preto oslovil nového odborníka na kryštalografiu. Navyše, konkurencia pri podobnom výskume dosiahla čiastočný pokrok, čo vedcov posunulo vpred. Výsledkom je výskum v uznávanom žurnále, ktorý viac ako polovicu zaslaných rukopisov odmietne ešte predtým, ako by si niekto okrem abstraktu prečítal aj celú štúdiu.
„Je to jeden z najuznávanejších a smer udávajúcich časopisov nielen v biologických vedách, ale v podstate vo všetkých vedných odboroch,“ dodáva Majtán.
Liečiť aj srdce
Pokračovaním výskumu cystationín beta-syntázy (CBS) môže byť lepšie chápanie toho, ako a kedy sa enzým aktivuje. Vedci však skúšajú vykryštalizovať aj mutantné formy enzýmu, vďaka čomu by mohli navrhnúť nové látky vhodné na liečbu. V konečnom dôsledku aj rôznych srdcovo-cievnych ochorení.
„Teraz už vieme, ako spolupracujú katalytická a regulačná doména CBS,“ zdôrazňuje slovenský vedec. „A to môže pomôcť pri racionálnom dizajne novej triedy liečiv.“
Majtán: V Spojených štátoch je ľahšie robiť vedu
V Amerike je cena často nižšia ako na Slovensku, je tu menej byrokracie a zbytočných obmedzení, hovorí mladý slovenský výskumník TOMÁŠ MAJTÁN.
Čo vlastne ten výskum ukázal? Čo ste objavili?
Objavili resp. vyriešili sme štruktúru "full-length" (katalytická doména spolu s regulačnou doménou) ľudskej cystationín beta-syntázy (hCBS). Enzým katalyzuje kondenzáciu homocysteínu so serínom za tvorby cystationínu a vody.
Je to kľúčový enzým v metabolizme sírových aminokyselín (metionín, cysteín), keďže stoji na kritickom bode v metabolickej dráhe, kde je zodpovedný za rozdelenie prúdu (flux-u) homocysteínu do konkurenčných metabolických dráh: konverzia späť na metioníne (metionínovy cyklus) alebo konverzia na cysteín (transulfuračná dráha).
Štruktúra katalytickej domény hCBS je známa od roku 2001 (nami) resp. 2002 (konkurenciou). V roku 2010 bola publikovaná v rovnakom časopise štruktúra "full-length" CBS z vínnej mušky (Drosophila melanogaster, dCBS) našou konkurenciou (Ruma Banerjee + Markos Koutmos lab). Ale naša štruktúra hCBS ukázala, že konformácia dCBS je výrazne odlišná oproti hCBS, čo ma zásadný význam pre pochopenie regulácie hCBS, keďže na rozdiel od dCBS je aktivita hCBS regulovaná AdoMet-om (ktorý je vlastne ten regulátor, ktorého efektor hCBS reguluje flux Hcy medzi kompetitívne dráhy).
Čo bol váš prínos k výskumu?
Moja práca spočívala v pokračovaní prípravy (purifikáciach) enzýmu pre kryštalizačné testy, ktoré začali už pred cca 2-3 dekádami (začiatok 90-tych rokov). Ale ako som zistil po cca 2 rokoch, nikam tento prístup neviedol. Tak som oslovil iného kryštalografa (Alfonza; minimálne štvrtý, ktorý s nami spolupracoval na tomto projekte od jeho začiatku), odborníka na CBS doménové proteíny, keďže hCBS v regulačnej doméne obsahuje tandem CBS motívov (po CBS boli tieto štrukturálne motívy pomenovane Bateman-om v roku 1997).To bol prvý kľúčový bod k úspechu (tj voľba správnych spolupracovníkov).
V roku 2010 bola našou konkurenciou publikovaná štruktúra dCBS (vid vyššie spomenutá referencia). To bol zlom pre mňa, tj druhy kľúčový bod. Na základe ich dCBS štruktúry som namodeloval štruktúru hCBS a identifikoval odlišný región: flexibilná slučka aminokyselín 516-525. Tak som to odstránil zo sekvencie hCBS, vypurifikoval a charakterizoval. Správalo sa to na nerozoznanie od natívnej hCBS (wild type) až na 2 fakty: menej to agregovalo a namiesto tetramérov to tvorilo diméry (ako napr. dCBS alebo katalytická podjednotka hCBS).
To bolo kľúčové, keďže nešpecifická agregácia je nepriateľ číslo jedna pre kryštalografiu. Nepriateľ číslo dva je štrukturálna flexibilita, ktorú sme tiež "zrovnali" vyhodením spomínaného úseku. Takže 2 benefity v 1 zásahu. Tento enzým som poslal Alfonzovi a ten urobil, čo vie najlepšie, a dostal difraktujúce kryštály, tj kryštály, ktoré rozptyľujú röntgenové lúče v takom vzore, ktorý nakoniec povedie k vyriešeniu 3D štruktúry. Tento proces nebol až tak "easy" a trvalo mu to cca rok a spotreboval na to veľké množstvá enzýmu, ktorý som pripravil.
Takisto využil jeden trik (autorské tajomstvo), ktorý nemohol urobiť nik iný, len on a ktorý znamenal rozdiel medzi úspechom a neúspechom, čo len potvrdilo správny výber spolupracovníka. Analýzou týchto difrakčných údajov nakoniec vyriešil štruktúru hCBS ako je prezentovaná v článku. Urobili sme okrem natívnej sekvencie (teda bez toho 516-525 regiónu, samozrejme) aj mutant D444N, ktorý spôsobuje ochorenie: homocystinúriu.
Čo by mohlo byt pokračovaním ich výskumu?
Pokračovaním výskumu je jednoznačné vyriešenie štruktúry hCBS s naviazaným alosterickym regulárom, AdoMet-om (S-adenosyl-L-metionín; mimochodom druha najpočetnejšia molekula v bunke po ATP, len tak pre zaujímavosť). Ten zvyšuje aktivitu hCBS niekoľkonásobne a tým spôsobuje flux homocysteníu do transsulfuračnej dráhy na produkciu cysteníu, glutatiónu a iných produktov.
Môže tento výskum viesť k liekom?
Samozrejme. Napríklad, teraz vieme, ako spolupracuje katalytická a regulačná doména CBS a ako prítomnosť regulačnej domény ovplyvňuje konformáciu aktívneho miesta natívneho "full-lenght" hCBS a tak reguluje aktivitu enzýmu, čo môže pomôcť pri racionálnom dizajne liečiv, ako napr. inhibítorov hCBS.
Tieto inhibítory by mohli slúžiť ako špecifické farmakologické "chaperony" pre mutantné formy enzýmu, stabilizovať ich a tak zaistiť aspoň ich minimálnu aktivitu. To by bolo postačujúce pre pacientov, ktorí nemajú žiadnu CBS aktivitu a pre ktorých doteraz nie je žiadna špecifická terapia. Štruktúra s AdoMet-om, keď ju vyriešime, bude ešte nápomocnejšia, lebo môžeme nadizajnovať nové molekuly nielen voči aktívnemu miestu, ale aj alosterickym miestam, kam sa viaže AdoMet.
Tých je až 6 na natívny tetramér, ako sme po prvýkrát vôbec ukázali v ďalšom kľúčovom texte na začiatku tohto roku, tiež v kvalitnom časopise s iným španielskym spolupracovníkom.
Je ťažké publikovať v PNAS? Čo to pre vedca znamená?
PNAS je multidisciplinárny časopis vydávaný americkou National Academy of Sciences. Aj keď nemá taký ranking ako napr. Nature (PNAS je 4., pričom Nature je 1. z 56 v multidisciplinary journals podľa ISI), je to jeden z najuznávanejších časopisov nielen v biologických vedách, ale v podstate vo všetkých vedných odboroch.
Je tam dosť ťažké publikovať, keďže viac ako 50% podaných manuskriptov rovno zamietnu, bez žiadneho čítania okrem názvu a abstraktu (napr. pre Nature je to takmer 90%, ale oni ročné odpublikujú cca 4-5x menej článkov ako PNAS, čo je tiež nezanedbateľný fakt).
Takže pre vedca to znamená prestíž, ocenenie úsilia, vysokú disseminaciu a impakt výsledkov na rôzne vedecké odbory.
Aký je rozdiel robiť vedu v zahraničí a u nás?
Toto je na dlho. V zásade, v Spojených štátoch je ľahšie robiť vedu, lebo je tam viac podpory z rôznych strán a systém je viac zabehanejší a funkčný na rozdiel od toho nášho.
Dostupnosť produktov/analýz je takmer okamžitá a ich cena je častokrát nižšia ako na Slovensku, je tam menej byrokracie a zbytočných obmedzení od vedeckého a hlavne nevedeckého personálu. Takže keby sa toto zlepšilo, tak sa to dá aj na Slovensku.
Ale podľa mňa je kľúčom ku všetkému správna spolupráca (na rozdiel od kompetície, ktorá je od určitej miery kontraproduktívna) a dostatočná domáca podpora (nielen finančná, ale hlavne, lebo keď si nevieme sami doma oceniť kvalitu, Európska únia to za nás nevyrieši. Ale v tejto téme vidím potenciál na ďalší článok či diskusiu.
Tomáš Prokopčák
